Введение. Важным направлением в биотехнологии культур опухолевых клеток является доклиническое тестирование и изучение механизмов действия противоопухолевых средств на морфофизиологические параметры клеток. В связи с этим, актуален поиск адекватных моделей опухолевых клеток in vitro, позволяющих охватить разные стороны действия противоопухолевого лекарственного средства, как цитотоксическое, так и цитостатическое.

Культура клеток почки эмбриона свиньи (SPEV-2) инфицирована онковирусами «а» и «с». В основном культуру используют в вирусологии, т.к. она обладает выраженной чувствительностью к вирусам: арбовирусы; ротавирус SA -11. От опухолевых клетки этой культуры отличаются отсутствием их морфологической трансформации, однако их в ряде случаев при применении разных флуоресцентных красителей, можно использовать как модель опухолевых клеток млекопитающих in vitro [2], для определения цитотоксического и цитостатического эффектов противоопухолевых лекарственных средств [3, 7].

Среди лекарственных средств, обладающих противоопухолевым действием, могут стать весьма перспективными экстракты из сырья растительного происхождения. Применение противоопухолевых средств на основе растительного сырья позволяет добиться более выраженного терапевтического эффекта с минимальным токсическим воздействием [6, 11]. Ранее нами [1, 4, 5, 11] на лабораторных животных с перевиваемыми опухолями было показано, что водный раствор сухого экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), наряду со слабой токсичностью, обладает антиоксидантными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. Детальные исследования экстракта аврана в экспериментах in vitro на клеточных культурах ранее не проводились, а механизмы цитотоксического влияния сухого спиртового экстракта травы аврана на опухолевые клетки до конца не изучены.

Цель работы – определить цитотоксичность в эксперименте in vitro раствора сухого экстракта аврана лекарственного на культуре клеток почек эмбриона свиньи, зараженных онковирусом (SPEV-2).

Материалы и методы. Использован флавоноидсодержащий экстракт сырья аврана лекарственного. Упаренный экстракт, полученный определенным способом [8, 9, 12], желто-коричневого цвета, смешивается с водой и этиловым спиртом в любых соотношениях. Среднее значение кверцетина, определенное по градуировочному графику со стандартным образцом кверцетина (Sigma, 98%) составляет 0,66%; количество кверцетина в сухом остатке экстрактивных веществ (на 10 г сухого сырья) - 350 мкг [9, 12]. Подлинность экстракта подтверждается качественными реакциями с кристаллическим магнием и реактивом Вагнера-Бушарда, результаты которых свидетельствуют о наличии флавоноидов и отсутствии алкалоидов [9]. Химический состав исследованного экстракта, установленный на газовом хромато-масс-спектрометре Finnigan, показал наличие в нем биофлавоноида кверцетина, а также: 4-винил-2-метоксифенола, 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он, 2,3-дигидробензофурана, 3-фуранкарбоновой кислоты, 5-гидроксиметил-2-фуральдегида, этил-a-d-рибозида, 4-пропилфенола, пирокатехина, L-луксозы (пентозы), 6-деоксигексозы L-галактозы, бензоилуксусной кислоты этилового эфира, пальмитиновой кислоты, гомованилиновой кислоты, глюкозы, 1,4-ангидро- d-маннитолы, бензойной кислоты.

Объектом послужила культура клеток почек эмбрионов свиньи (SPEV-2) из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН (г. Саратов). Культивирование проводили в среде RPMI 4 (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин) в 6 луночных планшетах (одной контрольной и пяти экспериментальных). Контролем служили клетки в среде без экстракта, выросшие в течение суток. В пять лунок вносили раствор экстракта, разведенный в питательной среде с понижением концентрации в каждой лунке в 10 раз: 3,2 мкг/мл; 32 мкг/мл; 320 мкг/мл; 3,2 мг/мл и 32 мг/мл. Клетки культивировали в CO₂-инкубаторе при 37^оС в течение 24 часов. В качестве красителя использовали йодистый пропидий, проникающий в клетки за счет разрушения их мембраны и связывающийся с ядерной ДНК [10]. Для визуализации клеток использовали комбинирование нескольких микроскопических режимов регистрации светорассеяния и флюоресценции на микроскопе Leica DM 2500, цифровую видеокамеру Leica DFC 420C с программным обеспечением Leica Application Suite V 3.1.

Для анализа клеток в контрольной и экспериментальной культурах использованы следующие усредненные показатели (10 полей зрения): общее количество клеток (живых и мертвых) в поле зрения (ОКК), свидетельствующее о пролиферативной активности; количество мертвых клеток в поле зрения, окрашенных пропидием в оранжевый цвет (КМК) и отношение числа мертвых клеток к общему количеству клеток в поле зрения, умноженное на 100% (индекс КМК), отражающее цитотоксическое действие. Отмечали также цитоморфологические признаки при микроскопии в фазовом контрасте: форма клеток, возникновение характерной внутриклеточной грануляции, состояние клеточной мембраны и др. Появление характерной внутриклеточной грануляции рассматривали, как свидетельство развития некробиотических процессов в клетке, отделения их от подложки и последующей гибели [10]. Распад ядерной ДНК на фрагменты неодинаковой величины (при флуоресцентном режиме) расценивали, как признаки апоптоза.

Статистическую обработку результатов проводили в программе «SPSS 13.0», значимость различий при параметрическом распределении определяли при помощи Т-Критерия Стьюдента для независимых выборок.

Результаты и  их обсуждение.     В контроле определяли клетки полигональной, треугольной и округлой форм, образующие ровный монослой и плотно прилегающие друг к другу. Только единичные клетки остаются не прикрепленными к подложке. Цитоплазма гомогенная, без грануляции.

При воздействии раствора экстракта аврана в концентрациях 3,2 мкг/мл; 32 мкг/мл и 320 мкг/мл, по сравнению с контролем, отмечали образование и увеличение внутриклеточной грануляции, а также значительное увеличение числа клеток, не прикрепленных к подложке, в результате чего их форма меняется до округлой. Доля погибших клеток в поле зрения при данных концентрациях 1,39%; 3,13% и 4,03%, соответственно (рис. 1). Установлено, что раствор экстракта в наименьшей концентрации - 3,2 мкг/мл - не обладает выраженным цитостатическим эффектом на клетки почки эмбриона свиньи, инфицированные онковирусом.

Рис. 1. Изменение числа клеток почек эмбрионов свиньи (SPEV-2) в контроле и в культуре с добавлением раствора экстракта аврана при разных концентрациях: Количество погибших клеток в поле зрения, число клеток в поле зрения, а также индекс погибших клеток, посчитанное как отношение числа погибших клеток к общему числу клеток, умноженное на 100. 

При концентрациях 3,2 мг/мл и 32 мг/мл выявлена значительная внутриклеточная грануляция. Клетки к подложке не прикреплены. Доля погибших клеток в поле зрения при воздействии обеими концентрациями - 100% , что свидетельствует о гибели всех клеток при данных концентрациях (рис. 1).

Максимальный цитотоксический эффект проявляется у раствора экстракта начиная с концентрации 3,2 мг/мл; такой же эффект сохраняется и при концентрации в 10 раз большей – 32 мг/мл.

Характер графиков (рис. 1), отражающих динамику изменения среднего количества мертвых клеток в поле зрения, окрашенных йодистым пропидием в оранжевый цвет, и доля мертвых клеток в поле зрения сходен. Минимальным значением концентрации раствора экстракта, оказывающим влияние на клетки по сравнению с контролем, служит 3,2 мкг/мл. Резкое изменение картины, наблюдающейся в культуре клеток с добавлением раствора экстракта в концентрации 320 мкг/мл и 3,2 мг/мл, требует проведения дополнительного исследования с серией концентраций с меньшим шагом в указанном диапазоне.

Выводы.  Таким образом, нами установлен цитотоксический эффект экстракта аврана in vitro в отношении культуры клеток SPEV-2, инфицированных онковирусом. Полученные данные вполне согласуются с данными по противоопухолевой активности данного экстракта, полученными in vivo при пероральном введении экстракта лабораторным крысам [5, 6, 11]. Минимальной концентрацией раствора экстракта из исследованных нами, оказывающей токсическое влияние на клетки в культуре, является 3,2 мкг/мл; а полную гибель клеток вызывает раствор экстракта аврана лекарственного в концентрации, начиная с 3,2 мг/мл.

Благодарности.  Работа выполнена с привлечением оборудования центра коллективного пользования «Симбиоз» ИБФРМ РАН. Авторы выражают благодарность ведущему научному сотруднику ИБФРМ РАН доктору биологических наук В.А.Богатыреву за методическую помощь в проведении микроскопических исследований.