Skip to Content

Морфологические изменения в почках при длительном пероральном введении золотых наночастиц

ID: 2014-01-1276-A-3316
Оригинальная статья
ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии

Резюме

.

Ключевые слова

золотые наночастицы, почки

Введение

За последние годы количество исследований и публикаций, посвященных нанотехнологиям, резко увеличилось [1].  Благодаря современным данным появилась отдельная отрасль науки – наномедицина, главная цель которой заключается в применении наноматериалов для диагностики, терапии и профилактики различных заболеваний.

Уже сейчас наноматериалы в медицине активно применяются как платформы для создания систем доставки активных лекарственных веществ, разработки новых методов и средств лечения, диагностики invivo и invitro, а также синтеза медицинских имплантатов.

В последние годы в различных областях наномедицины активно используются золотые наночастицы в диагностических и терапевтических целях[2]. В частности, их используют как носители для доставки лекарственных веществ, генетического материала, антигенов и как собственно лекарственное или диагностическое средство при терапии опухолей [3].

Практически одновременно с началом применения золотых наночастиц в биомедицинских приложениях возникли вопросы по поводу их биораспределения, циркуляции в кровяном русле, фармакокинетики и выведения из организма, а также возможной токсичности на уровне целого организма или на уровне отдельных клеток, органов и тканей.

Исследованию закономерностей распределения золотых наночастиц в организме лабораторных животных и изучению морфологических изменений, развивающихся под их влиянием в мягких тканях и внутренних органах, посвящена работа G. S. Terentyuk еtal.[4].  Ранее нами было установлено, что при 8-дневном пероральном введении золотых наночастиц морфологические изменения во внутренних органах носят размерно-зависимый характер [5].

Цель

изучение зависимости морфологических изменений и их обратимости в почках лабораторных животных от длительности перорального введения.

Материал и методы

Экспериментальное исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра фундаментальной медицины и нанотехнологий ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России. Эксперимент выполнен на 100 здоровых белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой тела 180-260 г, полученных из вивария СГМУ. При разработке модели экспериментального исследования в основу было положено «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005) и методические указания МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных".

В нашем исследовании использовались ЗНЧ разных размеров, синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН г. Саратов (зав. лабораторией докт. физ.-мат. наук Хлебцов Н.Г.): частицы коллоидного золота диаметром 1-3 нм, 15 нм и 50 нм с числовой концентрацией 1.3*1012шт/мл и 3.5*1010шт/мл, соответственно (концентрация золота 57 мкг/мл).

Наночастицы коллоидного золота синтезировали цитратным методом Фрэнса путем восстановления золотохлористоводородной кислоты (HAuCl4, Aldrich, USA) цитратом натрия. Средний размер ЗНЧ определяли по электронно-микроскопическим изображениям на микроскопе Libra-120 (CarlZeiss, Jena, Germany). Для увеличения биодоступности и биосовместимости ЗНЧ были конъюгированы с полиэтиленгликолем PEG-SH (Nektar, USA).

Для оценки влияния длительного воздействия золотых наночастиц размерами 1-3 нм, 15 нм и 50 нм на морфологическое строение почек лабораторных животных эксперимент проводился в две серии. В первой серии эксперимента с целью изучения влияния на морфологическое строение органов ЗНЧ разных размеров в дозировке 190 мкг/кг массы тела животного вводили один раз в день перорально в течение 8, 16 и 30 дней. Крысам контрольной группы вводили перорально по 1 мл физиологического раствора. Через 24 часа после последнего введения половина животных из каждой группы выводилась из эксперимента. Во второй серии эксперимента для изучения обратимости выявленных изменений в органах оставшиеся животные выводились из эксперимента через 14 суток после последнего введения золотых наночастиц.

Экспериментальные животные случайным образом были разделены на четыре группы (по 30 животных в опытных группах, 10 – в контрольной):

Первая группа – животным перорально вводились золотые наночастицы размерами 1-3нм, 15нм и 50нм в течение 8 дней (по 10 животных в подгруппах);

Вторая группа – золотые наночастицы размерами 1-3нм, 15нм и 50нм вводились перорально в течение 16 дней (по 10 животных в подгруппах);

Третья группа – золотые наночастицы размерами 1-3нм, 15нм и 50нм вводились перорально в течение 30 дней (по 10 животных в подгруппах);

Четвертая группа – контрольная.

Результаты

При гистологическом исследовании почек во всех группах животных, получавших золотые наночастицы разного размера в течение 8 дней, в препаратах четко определялись капсула, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество. Хорошо выявлялся сосочек и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием.

При введении животным ЗНЧ в течение 8-дневного периода существенных отличий морфологической картины между группами введения ЗНЧ разного размера не обнаружено. В группе животных, получавших ЗНЧ размером 1-3 нм, в 65% наблюдений полнокровие сосудов коркового вещества носило умеренный характер, в 35% случаев – выраженный. В группе животных, получавших ЗНЧ размером 50 нм, умеренное полнокровие сосудов коры было отмечено в 75% случаев, а выраженное полнокровие – в 25%. Во всех случаях введения ЗНЧ размером 15 нм была обнаружена умеренная степень полнокровия сосудов коркового вещества. Во всех группах клубочки имели нормальные размеры или были незначительно расширены за счет полнокровия капиллярных петель клубочков, просвет капсулы свободный. Клетки эпителия канальцев имели кубическую форму, были несколько увеличены в объеме, имели неровный апикальный край, контуры клеток были нечеткие, цитоплазма в состоянии зернистой дистрофии. Просвет извитых канальцев был сужен,  в некоторых полях зрения в просвете отмечался слущенный эпителий. В единичных эпителиоцитах отсутствовали ядра.

При изучении обратимости морфологических изменений в почках в группах животных, которым вводили ЗНЧ размерами 1-3 и 50 нм, отмечалось частичное восстановление кровенаполнения почек. Например, если полнокровие сосудов коркового вещества после окончания 8-дневного введения ЗНЧ 1-3нм в 65% наблюдений носило умеренный характер, в 35% случаев – выраженный, то через 14 дней в 60% наблюдений отмечалось умеренное полнокровие, в 25% случаев – выраженное, в 15% – незначительное. Полнокровие в группе животных с введением ЗНЧ 50 нм через 14 дней после окончания эксперимента приобретало умеренный характер. В группе животных, получавших ЗНЧ размером 15 нм, сохранялось умеренное полнокровие сосудов коры. В строении клубочкового аппарата почек через 14 дней после окончания введения ЗНЧ размерами 1-3 и 50 нм отмечалось уменьшение размеров клубочков с запустеванием капиллярных петель. В то же время при введении ЗНЧ 15 нм клубочки сохраняли нормальные размеры, капиллярные петли были умеренно полнокровны. Во всех исследуемых группах мезангиальные клетки в обычном количестве располагались между капиллярными петлями.  Через 14 дней после окончания введения ЗНЧ 15 нм наблюдалось восстановление структуры почек. В группах животных с введением ЗНЧ размерами 1-3 и 50 нм в большинстве случаев сохранялись зернистая дистрофия эпителия канальцев,  единичные некротизированные эпителиоциты.

При морфологическом исследовании почек в группах животных с 16-дневным введением ЗНЧ отмечались признаки нарушения кровообращения разной степени выраженности. Полнокровие сосудов коры при введении ЗНЧ 1-3 нм в 30% случаев носило незначительный характер, в 45% – умеренный, в 25% – выраженный. В группе животных, которым вводили ЗНЧ 15 нм, в 60% случаев отмечалась умеренная степень полнокровия сосудов коры, в 40% – выраженная. При введении ЗНЧ 50 нм обнаружено умеренное полнокровие сосудов коры. В группах животных с введением ЗНЧ 1-3 и 50 нм отмечалось уменьшение размеров клубочков с запустеванием капиллярных петель, в то время как в группе введения ЗНЧ 15 нм клубочки имели нормальные размеры, капиллярные петли были умеренно полнокровны. Дистрофические и некротические изменения в цитоплазме эпителиальных клеток извитых канальцев зависели от размера вводимых ЗНЧ. Наиболее выраженные изменения нами были обнаружены при введении ЗНЧ 1-3 и 50 нм: развивалась умеренная и выраженная степени дистрофии эпителия извитых канальцев соответственно, вплоть до некроза отдельных клеток. Цитоплазма эпителия канальцев при введении ЗНЧ 15 нм находилась в состоянии незначительной зернистой дистрофии.

При гистологическом исследовании на 14-й день после окончания 16-дневного введения ЗНЧ наблюдалось частичное восстановление морфологической картины почек. В группах животных, которым вводили ЗНЧ 1-3 и 15 нм, отмечалось частичное восстановление кровенаполнения органа. Например, выраженное полнокровие в группах 16-дневного введения ЗНЧ 1-3 нм наблюдалось в 25% случаев, ЗНЧ 15 нм – 40% случаев, в то время как при исследовании на 14 день отмечалось только умеренное полнокровие. Следует отметить, что в группе животных с введением ЗНЧ 50 нм сохранялось умеренное полнокровие. При морфологическом исследовании клубочкового аппарата почек на 14 день окончания 16-дневного введения ЗНЧ во всех исследуемых группах клубочки приобретали нормальные размеры, капиллярные петли были умеренно полнокровны. При исследовании на 14 день после окончания введения ЗНЧ 1-3 и 15 нм сохранялась незначительно выраженная дистрофия эпителия извитых канальцев. Дистрофические изменения эпителия канальцев в группе введении ЗНЧ 50 нм были представлены умеренной дистрофией, обнаруживались некротизированные эпителиоциты.

Морфологические изменения при введении ЗНЧ в течение 30 дней были представлены нарушением кровенаполнения разной степени выраженности, а также дистрофическими и некротическими изменениями в эпителии извитых канальцев. Полнокровие сосудов коры в группе животных с введением ЗНЧ 1-3 нм в 75% случаев носило умеренный характер, в 25% – незначительный. При введении ЗНЧ 15нм в 60% случаев отмечалась умеренная степень полнокровия сосудов коры, в 40% – выраженная. Во всех исследуемых случаях введения ЗНЧ 50 нм обнаружена выраженная степень полнокровия сосудов коры. Клубочки во всех группах введения ЗНЧ имели нормальные размеры, капиллярные петли были умеренно расширены, заполнены эритроцитами. В группах введения ЗНЧ 1-3 и 15 нм цитоплазма эпителиальных клеток извитых канальцев находилась в состоянии зернистой дистрофии, в некоторых полях зрения имела фрагментированный вид. Обращало на себя внимание наличие безъядерных эпителиальных клеток. При введении ЗНЧ 50 нм контуры клеток были нечеткие, отмечались выраженная дистрофия и фрагментация цитоплазмы эпителия извитых канальцев, некроз эпителиоцитов.

При исследовании на 14 день после окончания 30-дневного введения ЗНЧ полнокровие сосудов коры во всех исследуемых группах носило умеренный характер. При морфологическом исследовании клубочкового аппарата почек на 14 день окончания ЗНЧ клубочки сохраняли нормальные размеры, капиллярные петли в умеренном количестве были заполнены эритроцитами. В группах животных, которым вводили ЗНЧ 1-3 и 15 нм, выраженность дистрофии эпителия извитых канальцев в большинстве наблюдений уменьшалась до незначительной степени, в группе ЗНЧ 50 нм – оставалась выраженной. Таким образом, максимальное восстановление структуры органа наблюдалось в группах животных с введением ЗНЧ размерами 1-3 и 15 нм.

Обсуждение

Изучение влияния длительности введения ЗНЧ на морфологическую картину почек показало, что с увеличением времени эксперимента морфологические изменения в почках приобретают более выраженный характер.

Увеличение длительности введения ЗНЧ размером 1-3 нм сопровождалось изменениями в клубочковом аппарате почек и в эпителии извитых канальцев. При увеличении длительности введения ЗНЧ до 16 дней наблюдалось уменьшение размеров клубочков и запустевание капиллярных петель, в то же время при 30-дневном введении ЗНЧ 1-3 нм клубочки имели нормальные размеры, но развивались грубые изменения цитоплазмы эпителия канальцев в виде ее фрагментации, некроз эпителиоцитов.

Обратимость морфологических изменений в почках при введении ЗНЧ 1-3 нм зависела от длительности эксперимента. При исследовании на 14 день после окончания введения животным ЗНЧ 1-3 нм отмечалось уменьшение клубочков и запустевание капиллярных петель, в то время как при увеличении длительности введения до 16 и 30 дней клубочки приобретали нормальные размеры. Дистрофические изменения эпителия извитых канальцев носили незначительный характер.

В группах животных, которым вводили ЗНЧ 15 нм, увеличение длительности эксперимента сопровождалось изменением степени выраженности дистрофических и некротических процессов в эпителии почечных канальцев с незначительной дистрофии (в группах 8 и 16-дневного введения) до умеренно выраженной (при 30-дневном введении).

При исследовании обратимости морфологических изменений в группах животных, которым вводили ЗНЧ 15 нм, максимальное восстановление морфологической картины почек отмечалось при 8-дневном введении: сохранялось умеренное полнокровие, в нескольких полях зрения отмечались участки незначительной дистрофии эпителия.

В группах животных с введением ЗНЧ 50 нм с увеличением длительности эксперимента отмечалось нарастание степени полнокровия (до выраженной степени при 30-дневном введении), появление выраженной дистрофии и некроза эпителия извитых канальцев (в группах 16- и 30-дневного введения).

Обратимость морфологических изменений в почках при введении ЗНЧ 50 нм определялась длительностью эксперимента. Минимальные дистрофические изменения нами были обнаружены при 8-дневном введении (незначительная степень зернистой дистрофии), максимальные – при 30-дневном (выраженная зернистая дистрофия, некроз эпителия).

Заключение

Таким образом, выраженность и обратимость морфологических изменений в почках зависела от сроков введения, а не от размеров наночастиц: при более длительном введении нарастала выраженность морфологических изменений,  максимальное восстановление структуры почек наблюдалось в группе животных с изначальным минимальным периодом введения ЗНЧ.

Литература

  1. Akchurin G. G., Khlebtsov B. N., Khlebtsov N. G., Kolbenev I. O., Lychagov V. V., Maksimova I. L., Ryabukho V. P., Skaptsov A. A., Terentyuk G. S., Tuchin V. V. Dynamic of gold nanoparticles labeling studied on the basis of OCT and backscattering spectra of tissues and phantoms // Proc. SPIE. 2008. Vol. 6855. P. 68550K.
  2. Хлебцов Н. Г., Дыкман Л. А. Биораспределение и токсичность золотых наночастиц // Российские нанотехнологии. 2011. Т. 6, № 1-2. С. 1-21.
  3. Khlebtsov N. G., Dykman L. A. Optical properties and biomedical applications of plasmonic nanoparticles // J. Quant. Spectr. Radiat. Transfer. 2010. Vol. 111. P. 1-35.
  4. Circulation and distribution of gold nanoparticles and induced alterations of tissue morphology at intravenous particle delivery / G. S. Terentyuk, G. N. Maslyakova, L. V. Suleymanova [et al.] // J. Biophotonics. 2009. Vol. 2. P. 292-302.
  5. Маслякова Г. Н., Пахомий С. С., Бучарская А. Б., Злобина О. В., Наволо-кин Н. А., Понукалин А. Н., Хлебцов Н. Г., Хлебцов Б. Н., Богатырев В. А. Морфологические изменения в органах лабораторных животных при длительном пероральном введении золотых наночастиц // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9, № 2. С. 208-213.
0
Ваша оценка: Нет



Яндекс.Метрика